PENGUJIAN SIFAT BIOKIMIA

 BAB I

PENDAHULUAN

1. Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk mengenalkan kepada mahasiswa  dengan beberapa pengujian biokimia yang digunakan untuk karakterisasi dan identifikasi mikrobia. 

2. Dasar Teori

Sifat biokimia adalah proses kimia yang terjadi di dalam zat hidup. Sel hidup itu tidak lain adalah kumpulan zat tidak hidup, zat ini dapat diisolasi dan dipelajari dengan berbagai cara kimia dan fisika seperti yang biasa dilakukan terhadap senyawa kimia. Sel hidup (pada mikrobia) zat tersebut bercampur, bereaksi dan berinteraksi satu dengan yang lainnya membentuk suatu susunan yang rumit tetapi terorganisasi dengan rapi (Murray, 1995). Metabolisme merupakan reaksi-reaksi kimia yang terjadi pada makhluk hidup. Aktivitas metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Berdasarkan tempat bekerjanya, bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim yaitu enzim yang berkerja dalam sel, sedangkan eksoenzim yaitu enzim yang disekresikan ke luar sel dan berdifusi ke dalam media. Molekul-molekul yang lebih kecil ini kemudian dapat memasuki sel dan digunakan untuk kepentingan sel. Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi (Waluyo, 2004).

Mikroorganisme yang berbentuk bakteri mampu berada di berbagai tempat baik melalui udara, bercampur dalam padatan dan berpindah tempat mengikuti aliran  air atau melekat pada benda-benda yang cocok untuk tumbuh dan berkembang. Bakteri tumbuh dan berkembang pada lingkungan karena adanya nutrien yang tersedia, suhu yang sesuai, keasaman atau kebasaan (pH) tempat tumbuh, kandungan udara dan kelembaban udara. Untuk mengidentifikasi jamur dan bakteri disamping ciri morfologinya masih harus dilengkapi dengan sifat-sifat fisiologi dan reaksi biokimia. Khusus untuk jamur pengamatan dilakukan terhadap perubahan warna pada koloni, keadaan permukaan koloni (rata, menggunung, seperti tepung, berbutir-butir, beludru atau seperti kapas), ada tidaknya garis-garis radial, adanya garis atau lingkaran konsentris, ada tidaknya kleistosia, ada tidaknya tetesan serta warnanya, ada tidaknya bau yang khas, juga keadaan bagian belakang koloni. Dalam kondisi aerobik atau anaerobik bakteri dapat mereduksi sulfat menjadi  sulfida yang selanjutnya menimbulkan korosi pada permukaan logam. Gabungan berbagai sel-sel mikroorganisme  atau biofilm melekat kuat pada permukaan logam. Proses pelekatan ini disertai oleh penumpukan bahan-bahan organik yang diselubungi oleh polimer ekstraseluler. Mikroba di lingkungan pada umumnya berada dalam populasi campuran, sulit ditemukan mikroba dijumpai  sebagai spesies tunggal. Untuk itu dibutuhkan metode isolasi agar dapat mencirikan dan mengidentifikasi suatu mikroorganisme tertentu. Pertama kali harus dapat dipisahkan dari mikroorganisme lainnya yang dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni. Terdapat  dua metode untuk memperoleh biakan murni yaitu teknik cawan gores dan cawan tuang. Kedua teknik ini berdasarkan pada pengenceran organisme sehingga dapat dipisahkan hanya  spesies tertentu berada sebagai sel tunggal. Dengan demikian dapat diperoleh ciri- ciri kultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis (Karliana, 2009).

Produk toksik H2O2 yang dipecah menjadi H2O dan O2 dipecah menggunakan enzim katalase yang terdapat secara luas dalam jaringan, khususnya hati, meskipun reaksi oksidase asam amino bersifat reversibel, jika katalase tidak ada maka produk asam α keto akan mengalami dekarboksilasi nonenzimatik oleh H2O2 hingga terbentuk asam karboksilat dengan kurang satu karbon. Katalase mempunyai daya katalitik yang besar merupakan golongan enzim yang memperoleh kinetik sempurna. Asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, pepton, dan peptida. Triptofan merupakan asam amino yang penting untuk mengetahui jenis bakteri tertentu karena beberapa bakteri mampu menghidrolisa asam amino ini. Hasil hidrolisis triftofan adalah senyawa indol yang dapat diamati dengan tes kalorimeter (Murray, 1995).

Peroksidase mengkatalisis reaksi analog yaitu reduksi alkil peroksida menjadi air dan alkohol oleh suatu reduktan (AH2) dapat berupa sitokrom C atau askorbat (Strayer, 2000). Hasil uji indol yang diperoleh negatif apabila tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini  tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber carbon (Hafiz,2008). H2S diproduksi oleh beberapa bakteri melalui pemecahan asam amino yang mengandung unsur belerang seperti sistin dan metionin. H2S dapat juga diproduksi melalui reduksi senyawa-senyawa. Belerang anorganik misalnya, tiosulfit, sulfit atau sulfat. H2S yang terjadi dapat diamati dengan menambahkan garam-garam logam berat ke dalam medium. H2S akan bereaksi dengan senyawa-senyawa ini membentuk logam sulfida yang berwarna hitam. Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen yaitu zat pada jaringan penghubung dan tendon hewan. Gelatin akan terurai oleh mikrobia yang mensintesis enzim proteolisis. Larutan gelatin bersifat cair pada suhu ruangan atau suhu kamar dan padat apabila berada dalam refrigerator, dan apabila gelatin sudah dihidrolisis oleh mikrobia akan bersifat cair (Murray,1995).

BAB II

METODE PRAKTIKUM

1. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin  tanggal 25 Maret 2013, pukul 09.00 – 12.00. Bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Metematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru.

2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah gelas objek, lup inokulasi, jarum ose steril, tabung reaksi, lampu bunsen dan pipet tetes.

Bahan yang digunakan adalah biakan E. coli, B. subtilis, Proteus Sp, S. aureus larutan H2O2 3%, reagent Ehrlich medium triptone broth, triple sugar ion agar (TSIA), dan nutrient gelatin.

3. Cara Kerja

1. Uji Katalase

1. Mengambil 1 ose biakan E. coli dari tabung reaksi dengan lup inokulasi.

2. Meletakkan pada gelas objek biakan tersebut.

3. Menetesi dengan 0,5 mL H2O2 3%.

4. Melakukan hal yang sama untuk biakan B. Subtilis.

5. Mengamati adanya gelembung-gelembung O2 yang terbentuk dari hasil ketiga macam bakteri tersebut pada gelas objek.

2. Produksi Indol  

1. Mengambil 1 ose biakan E. coli dengan jarum ose.

2. Memasukkan ke dalam tabung yang beisi medium triptone broth (diinokulasi).

3. Memvortex dengan vortex mixer.

4. Menginkubasi pada suhu 35-37°C selama 24 jam.

5. Menggunakan tabung yang berisi medium tanpa diinokulasikan sebagai kontrol.

6. Menambahkan 0,5 ml reagent ehrlich ke dalam setiap tabung, setelah diinkubasi selama 24 jam.

7. Mengamati adanya indol dengan timbulnya cincin berwarna merah keunguan (purplish-red) pada lapisan atas permukaan media.

3. Produksi H2S

1. Menginokulasikan bakteri Proteus vulagaris ke dalam medium triple sugar iron agar (TSIA) secara gores, dan diakhiri dengan ditusuk (tegak).

2. Menginkubasikan selama 24 jam pada suhu 30°C-35°C.

3. Melakukan hal yang sama untuk bakteri Seratia marcescens.

4. Mengamati terbentuknya H2S, setelah diinkubasi selama 24 jam yang ditunjukkan oleh adanya warna hitam di sepanjang tusukan.

5. Mengamati pula perubahan warna pada medium tersebut akibat fermentasi gula-gula dan adanya pembentukan gas.

4. Hidrolisis Gelatin

1. Menyiapkan tabung-tabung yang berisi medium nutrient gelatin.

2. Menginokulasikan masing-masing medium dengan biakan E. coli dan S. Aureus.

3. Menggunakan tabung-tabung nutrient gelatin sebagai kontol.

4. Menginkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam.

5. Menguji adanya hidrolisis setelah 1 hari dengan cara tabung yang berisi biakan dibenamkan pada potongan es batu yang sedang mencair.

6. Mengamati perubahan yang terjadi (beku atau cair), jika cair maka terhidrolisis, jika beku tidak terhidrolisis. Kontol dan gelatin akan tetap beku

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Hasil

Hasil yang didapat dari pengamatan ini adalah :

Tabel 1. Hasil Dari Pengujian Katalase

No.	Bakteri	Gambar	Keterangan
1.	E. coli		Positif (+) terbentuk gelembung O2
22.	B. subtilis		Positif (+) terbentuk gelembung O2

Tabel 2. Hasil Pengamatan Produksi Indol

No.	Bakteri	Gambar	Keterangan
1.	E. coli		Negatif (-) tidak terjadi perubahan Keterangan : a. Bakteri E. coli b. Kontrol
2.	B. subtilis		Negatif (-) tidak terjadi perubahan Keterangan : a. Bakteri B. subtilis b. Kontrol

Tabel 3. Hasil Pengamatan Produksi H2S

No.	Bakteri	Gambar	Keterangan
1.	Proteus sp.		Negatif (-) tidak terjadi perubahan Keterangan : a. Bakteri Proteus sp. b. Kontrol
2.	S. aureus		Negatif (-) tidak terjadi perubahan Keterangan : a. Bakteri S. aureus b. Kontrol

Tabel 4. Hasil Pengamatan Hidrolisis Gelatin

No.	Bakteri	Gambar	Keterangan
1.	E. coli		Positif (+) Gelatin terhidrolisis Keterangan : a. Bakteri E. coli b. Kontrol
2.	S. aureus		Positif (+) Gelatin terhidrolisis Keterangan : a. Bakteri S. aureus b. Kontrol

2.   Pembahasan

Praktikum ini bertujuan untuk mengenalkan kepada mahasiswa dengan beberapa pengujian biokimia yang digunakan untuk karakterisasi dan identifikasi mikrobia. Melakukan identifikasi suatu mikrobia hasil isolasi, tidak cukup hanya berdasarkan sifat morfologinya saja. Akan tetapi perlu pula diteliti sifat biokimianya. Uji biokimia adalah uji yang dilakukan untuk melakukan identifikasi suatu mikrobia hasil isolasi dengan melihat sifat biokimianya. Selain itu uji biokimia bertujuan untuk mengetahui reaksi apa saja yang terjadi bila ditambahkan suatu senyawa atau larutan tertentu. Sehingga dapat diketahui kemampuan suatu bakteri untuk menghasilkan suatu produk setelah mendapat reaksi, dan juga dapat diketahui apakah bakteri tersebut termasuk dalam bakteri gram positif atau negatife. Praktikum ini menggunakan beberapa pengujian biokimia untuk karakterisasi dan identifikasi mikrobia. Diantaranya uji katalase, produksi indol, produksi H2S, hidrolisis gelatin.  

Uji katalase, praktikum ini menggunakan biakan bakteri Bacillus subtilis dan Echerichia coli. Tujuan pengujian ini adalah untuk mengetahui bakteri mana yang menghasilkan enzime katalase dan diketahui menunjukkan reaksi positif terhadap uji katalase. Apabila positif hal tersebut dapat dilihat dari adanya gelembung-gelembung gas yang dihasilkan setelah kedua bakteri tersebut ditetesi dengan H2O2 3 % pada gelas objek. Pada percobaan ini didapatkan hasil positif pada kedua bakteri karena adanya gelembung-gelembung yang dihasilkan pada bakteri tersebut, akan tetapi jumlah gelembung bakteri Bacillus subtilis  lebih banyak daripada Echerichia coli. Gelembung-gelembung ini terjadi sebagai hasil perubahan peroksida (H2O2) dengan bantuan enzim katalase dan sangat diperlukan oleh sebagian besar bakteri untuk merubah H2O2 menjadi O2 dan H2O.  Uji katalase adalah suatu produk toksik H2O2 yang dipecah menjadi H2O dan O2 dipecah menggunakan enzim katalase yang terdapat secara luas dalam jaringan khususnya hati, meskipun reaksi oksidase asam amino bersifat reversibel, jika katalase tidak ada maka produk asam α keto akan mengalami dekarboksilasi nonenzimatik oleh H2O2 hingga terbentuk asam karboksilat dengan kurang satu karbon. Reaksi yang terjadi berlangsung sebagai berikut : 

2H2O2  🡪 2H2O + O2     (Hafiz, 2008)

Terbentuknya enzim katalase ini dapat membantu membedakan kelompok bakteri-bakteri tertentu. Kebanyakan bakteri aerobik dan anaerobik fakultatif yang menggunakan oksigen menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang bersifat racun bagi sistemnya enzimenya sendiri, tetapi bakteri ini dapat bertahan dengan adanya antimetabolit yang dihasilkan enzim katalase. Bakteri anaerob obligat akan mati jika ada oksigen karena tidak adanya pembentukkan enzim katalase sehingga H2O2 meracuni bakteri tersebut (Hafiz, 2008).

Pengujian produksi indol menggunakan  jenis bakteri Echerichia coli dan Bacillus subtilis. Setelah bakteri diinkubasi dan ditetesi dengan larutan 0,5 ml reagen Ehrlich didapatkan hasil yaitu kedua bakteri tersebut termasuk bakteri gram negatife hal ini disebabkan tidak terbentukya cincin berwarna merah keunguan (purplish-red) pada lapisan atas permukaan medium. Produksi indol adalah suatu media yang biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini  tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber carbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovaktor. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Jenis bakteri tersebut dapat mehidrolisis asam amino triptofan menjadi indol dan asam piruvat melalui kerja enzim triptofanase. Triptofan merupakan asam amino yang penting untuk mengetahui jenis bakteri tertentu, karena beberapa bakteri mampu menghidrolisis asam amino tersebut (Hafiz, 2008).

Pengujian produksi H2S menggunakan biakan bakteri Proteus sp. dan Saccharomyces cereviciae yang ditaruh pada media triple sugar iron agar (TSIA). Penggunaan medium ini pada prinsipnya adalah untuk menentukan kemampuan organisme untuk menyerang suatu karbohidrat yang tergabung dalam pembenihan basal dengan atau tanpa pembentukan gas disertai penentuan kemungkinan terbentuknya H2S. Produksi H2S akan positif jika adanya warna hitam di sepanjang tusukan medium. Hasil yang didapat adalah pada kedua media tersebut tidak ada warna hitam disepanjang tusukan. Hasil uji produksi H2S, jenis bakteri tersebut tidak dapat memproduksi H2S karena menunjukkan hasil yang negatif. H2S diproduksi oleh beberapa bakteri melalui pemecahan asam amino yang mengandung unsur belerang seperti sistin dan metionin. Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan CO2 dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar. Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam, endapan ini terbentuk karena bakteri mampu mendesulfurasi asam amino dan methion yang akan menghasilkan H2S dan akan bereaksi dengan Fe++  yang terdapat pada media dan menghasilkan endapan hitam. Produksi H2S merupakan langkah awal di dalam proses deaminasi sisteina  dari protein yang mengandung gugus sulfur seperti pada reaksi berikut :

CH2SH                 CH2     CH3           CH3

     H—C—NH2  🡪  H2S  +  C—NH2   🡪 C = NH 🡪 C = O   +  NH2

COOH                   COOH          COOH       COOH

      Sisitein   Asam Asam

α-amino           amino piruvat            (Hafiz, 2008)

  akrilat

Uji gelatin pada prinsipnya adalah untuk menentukan kemampuan organisme untuk membentuk enzim semacam proteolitik (gelatinase) yang mencairkan gelatin. Gelatin akan terurai oleh mikroba yang mensintesis enzim proteolisis. Mikrobia yang digunakan pada praktikum ini adalah yaitu bakteri bakteri Echerichia coli dan Saccharomyces cereviciae serta tabung nutrient gelatin sebagai nutrien gelatin sebagai kontrol, setelah 2 hari didapatkan hasil pada Bacillus subtilis dan Echerichia coli ternyata cair dan tidak terhidrolisis, sedangkan pada kontrol didapat hasil beku terhidrolisis. Media yang beku setelah direndam dengan es menunjukkan bahwa bakteri tersebut dapat menghidrolisis gelatin. 

BAB IV

PENUTUP

1. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diperoleh kesimpulan sebagai berikut : 

1. Uji katalase didapatkan hasil positif pada kedua bakteri karena adanya gelembung-gelembung yang dihasilkan pada bakteri tersebut, akan tetapi jumlah gelembung bakteri Bacillus subtilis  lebih banyak daripada Echerichia coli. Gelembung-gelembung ini terjadi sebagai hasil perubahan peroksida (H2O2) dengan bantuan enzim katalase dan sangat diperlukan oleh sebagian besar bakteri untuk merubah H2O2 menjadi O2 dan H2O.

2. Uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini  tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kofaktor.

3. Uji produksi H2S, jenis bakteri tersebut tidak dapat memproduksi H2S  dan menunjukkan hasil yang negatif  karena hasil yang didapat adalah pada kedua media tersebut tidak ada warna hitam disepanjang tusukan.

4. Uji gelatin pada bakteri bakteri Echerichia coli dan S. aureus serta tabung nutrient gelatin sebagai nutrien gelatin sebagai kontrol, setelah 2 hari didapatkan hasil pada Bacillus subtilis dan S. aureus  ternyata cair dan tidak terhidrolisis, sedangkan pada kontrol didapat hasil beku terhidrolisis.

2. Saran

Praktikum yang akan datang hendaknya dalam bekerja di ruang mikrobiologi perlu hati-hati agar tidak terjadi kontaminasi.

DAFTAR PUSTAKA

Hafiz. Uji Biokimia Mikroba. 2008. http://hafizluengdaneun.multiply.com/journal/item/1/Laporan_KoasistensiMikrobiologi_ 

Diakses tanggal 18 April 2011.

Karliana, I. 2009. Identifikasi Mikroba Air Laut Di Ujung Grenggengan Semenanjung Muria. Sigma Epsilon ISSN  0853-9103 Vol.13  No. 2.

Murray, R.K.  1995.  Biokimia Harper Edisi 22.  Buku Kedokteran ECG. Jakarta.

Strayer, L. 2000. Biokimia Vol 2. Penerbit buku kedokteran EGC. Jakarta.

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhamadiyah Malang: Malang.